Влияние ММСК и ГСК на репаративную регенерацию печени в условиях ее токсического повреждения

УДК 616.36-003.93:576.54

И.Ю. Маклакова ^1, 2, В.В. Базарный ¹, Д.Ю. Гребнев ^1, 2

¹ ФГБУ ВО «Уральский государственный медицинский университет», г. Екатеринбург, Российская Федерация;

² ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», г. Екатеринбург, Российская Федерация

Резюме. Целью настоящего исследования стало изучение влияния сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на показатели регенерации печени в условиях ее токсического повреждения тетрахлорметаном. Материалы и методы. Исследование выполнено на белых мышах-самцах с токсическим повреждением печени путем внутрибрюшинного введения тетрахлорметана в дозе 50 мкл на мышь однократно. Через час после моделирования повреждения печени осуществлялось внутривенное введение плацентарных ММСК и ГСК соответственно в дозе 4 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl — 0,2 мл внутривенно. На 1, 3, 7 сутки после трансплантации клеток производилась оценка изменения воспалительной активности в печени, определение митотического, апоптотического индексов. На 7 сутки после введения клеток производился анализ активности ферментов репарации ДНК семейства PARP. Результаты. Сочетанная трансплантация ММСК и ГСК приводит к снижению индекса воспалительной активности в печени вследствие уменьшения некроза, дистрофии гепатоцитов, снижения инфильтрации. В результате исследования установлено повышение активности ферментов репарации системы PARP, что привело к уменьшению запрограммированной клеточной гибели. Также котрансплантация ММСК и ГСК сопровождалась повышением митотической активности гепатоцитов. Заключение. Котрансплантация ММСК и ГСК в условиях токсического повреждения печени снижает воспалительную реакцию, стимулирует митотическую активность гепатоцитов, повышает активность ферментов системы репарации ДНК. Активация репаративной системы печени, в свою очередь, обеспечивает снижение запрограммированной гибели гепатоцитов.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, токсический гепатит, репаративная регенерация печени

Конфликт интересов отсутствует.

Контактная информация автора, ответственного за переписку:

Гребнев Дмитрий Юрьевич

dr-grebnev77@mail.ru

Дата поступления 03.12.2020 г.

Образец цитирования:

Маклакова И.Ю., Базарный В.В., Гребнев Д.Ю. Влияние ММСК и ГСК на репаративную регенерацию печени в условиях ее токсического повреждения. http://vestnikural.ru/article/1143. [Электронный ресурс] Вестник уральской медицинской академической науки. 2020, Том 17, №3, с. 243–248, DOI: 10.22138/2500-0918-2020-17-3-243-248

Введение

Печень — многофункциональный орган, участвующий в различных метаболических процессах, поэтому нарушение его функции приводит к серьезному нарушению обмена веществ в организме. Введение тетрахлорметана используется с 1928 года для изучения механизмов токсического повреждения печени на лабораторных животных [1]. Известно, что в повреждении печени важную роль играют активные формы кислорода. Тетрахлорметан в клетках печени метаболизируется под влиянием цитохрома P-450 с образованием активных форм кислорода [2]. Окислительный стресс, вызванный большим количеством свободных радикалов, вызывает повреждение печени. В настоящее время продолжается поиск эффективных способов восстановления структуры и функции печени после ее токсического повреждения. Перспективным в лечении повреждений печени представляется использование котрансплантации двух видов клеток: мультипотентных мезенхимальных стромальных (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). ММСК способны к синтезу противовоспалительных цитокинов, факторов роста [3, 4]. Иммуномодулирующие свойства ММСК позволяют проводить сочетанную трансплантацию двух видов клеток [5]. Доказана способность ГСК активировать регенерацию печени как путем дифференцировки в гепатоциты, так и с помощью слияния с клетками печени (fusion-effect). Кроме того, ММСК секретируют SDF-1 (Stromalderivedfactor-1), который стимулирует миграцию аллогенных и аутологичных ГСК в поврежденную печень [6]. Перспективным источником стволовых клеток является плацента, так как получение ее не связано с оперативным вмешательством и не влечет за собой этических проблем. Кроме того, плацентарные клетки обладают большим пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Таким образом, целью данного исследования стало изучение влияния котрансплантации плацентарных ММСК и ГСК на репаративную регенерацию печени в условиях ее токсического повреждения.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 42 белых мышах-самцах возраста 7-8 месяцев, массой 20-23 г. Производилось выделение культуры ММСК из хориона плаценты 5 лабораторных животных мышей-самок возраста 3-4 месяца, срок гестации 18 дней. Мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты. Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, СШA) и CD 117 (StemCell Technologies, СШA) (X. Muniraetal., 2009).Все эксперименты, уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с Директивой №63 от 22 сентября 2010 года Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Выполнение исследований одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» протокол №8 от 20.10.2017.

Культивирование ММСК проводилось в условиях СО2 — инкубатора (TermoScientific, США) при температуре 37 ^°C с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Для трансплантации лабораторным животным были использованы ММСК третьего пассажа. Идентификация ММСК проводилась иммуноцитохимическим методом с использованием набора MesenchymalStemCellCharacterizationKit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagentypeI и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45). Изучение функциональных свойств выделенных клеток было проведено путем направленной дифференцировки полученной культуры в направлениях, характерных для ММСК — в адипоцитарном и остеогенном. Идентификация ГСК была проведена на проточном цитометре BeckmanCoulterNavios. В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119). Содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+, Sca-1+, Lin- составило 80-93%. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего и перед трансплантацией составила 95-97%. Животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 4 млн клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl — 0,2 мл внутривенно. Внутривенные введения осуществлялись через 1 час после введения тетрахлорметана.

Исследовалось влияние сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на показатели регенерации печени на 1, 3, 7 сутки после внутрибрюшинного введения тетрахлорметана в дозе 50 мкл на мышь однократно.Из опыта животных выводили декапитацией под легким эфирным наркозом. Изготавливали гистологические срезы печени толщиной 3-5 мкм, окрашивали гематоксилином-эозином. Для морфометрического анализа данных использовали компьютерную программу анализа изображений (Biovision, Россия). С этой целью производили микрофотосъемку случайных полей зрения гистологических препаратов цифровой камерой OLYMPUS XC30 на базе микроскопа OLYMPUS BX51 (OLYMPUS, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400, ×600, ×1000 (не менее 10 полей зрения в каждом гистологическом срезе).

Для количественной оценки выраженности воспалительных явлений в ткани печени был введен индекс воспалительной активности (ИВА). При этом производился анализ следующих гистологических изменений: 1) некрозы гепатоцитов – оценивались от 0 до 10 баллов; 2)дистрофия гепатоцитов % оценивались от 0 до 4 баллов; 3) воспалительный инфильтрат % оценивался от 0 до 4 баллов. ИВА определялся по сумме полученных баллов. Также производился расчет митотического индекса (МИ) гепатоцитов, апоптотического индекса (АИ), выраженные в промилле. Верификация выраженности апоптоза осуществлялась с использованием метода ApopTag® PeroxidaseInSituOligoLigation (ISOL) (Millipore, США).Апоптотический индекс определялся как отношение числа клеток в состоянии апоптоза к общему числу подсчитанных гепатоцитов.

С целью оценки выраженности репаративных процессов в клетках печени производился анализ количества Поли-АДФ-рибозаполимера (PARP), который является продуктом реакции Поли-АДФ-рибозилирования. По количеству этого полимера можно судить об активности ферментов репарации ДНК. Определение уровня данного показателя осуществлялось в клетках печени с использованием первичных (Anti-Poly (ADP-Ribose) Polymer antibody, abcam) и вторичных антител (Rabbit Anti-Chicken IgY H&L (FITC), abcam) на проточном цитометре Beckman Coulter по методу A. Kunzmann, D. Lui, K. Annett на 7 сутки после моделирования токсического повреждения печени. Определялась средняя интенсивность флуоресценции популяции клеток (MFI), которая служит количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) внутри клетки.

Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением t-критерия Стьюдента. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSSStatistics (версия 17,0).

Результаты и обсуждения

Повреждение печени тетрахлорметаном сопровождается развитием воспалительной реакции с гиперпродукцией цитокинов и хемокинов. На гистологических препаратах печени наблюдаются зоны некрозов, вакуольная дистрофия гепатоцитов, лимфоцитарная инфильтрация. На первые сутки после сочетанного введения ММСК и ГСК на фоне токсического повреждения печени при анализе выраженности индекса воспалительной активности в печени не выявлено достоверных отличий между опытной и контрольной группами. На 3 сутки после введения тетрахлорметана в опытной группе получено уменьшение инфильтрации и дистрофии гепатоцитов, что привело к снижению индекса воспалительной активности. На 7 сутки также имеются отличия между опытной и контрольной группами. Снижение индекса воспалительной активности произошло за счет сокращения зон некрозов, уменьшения дистрофии гепатоцитов, снижения воспалительной инфильтрации (таблица 1). Уменьшение интенсивности воспалительного процесса в печени может быть обусловлено способностью ММСК к синтезу спектра противовоспалительных цитокинов (TGF-β, ИЛ-10), а также ГСК к синтезу TGF-β. Известно, что TGF-β оказывает противовоспалительное действие за счет уменьшения выработки клетками иммунной системы ИЛ-1, ФНО, за счет торможения пролиферации Т- и В-лимфоцитов, подавления активности макрофагов.

Таблица 1

Выраженность воспалительных явлений в печени мышей после введения CCl4, M±m, n=7

Примечание: * отличие от контрольной группы животных, достоверно с p<0,05

Введение тетрахлорметана привело к повышению митотической активности гепатоцитов. Это произошло в результате выраженного воспалительного ответа в печени, что сопровождается повышенной экспрессией транскрипционного фактора NF-kB, который усиливает пролиферацию гепатоцитов [7]. Развивающая в очаге воспаления гипоксия, накопление активных форм кислорода повреждают мембрану митохондрий, что ведет к высвобождению цитохрома С. В результате активируется каспаза 9 и запускается процесс апоптоза.

Токсическое повреждение печени вызывает компенсаторное повышение активности ферментов репарации ДНК семейства PARP. После котрансплантации ММСК и ГСК установлено еще большее повышение активности этих ферментов по сравнению с контрольной группой (рисунок 1).

Рис.1. Показатели активности ферментов репарации ДНК семейства PARP

Возможным механизмом активации системы репарации ДНК может быть способность трансплантируемых ММСК индуцировать в клетках синтез белков теплового шока (70 кД) — шаперонов [8, 9]. Эти белки обеспечивают поддержание структуры и функции ферментов репарации в условиях действия повреждающего фактора. Повышение уровня ферментов системы репарации ДНК приводит к уменьшению количества повреждений в клетке, что снижает активацию инициирующих и эффекторных каспаз и, как следствие, угнетает выраженность запрограммированной клеточной гибели.

В результате исследования получено, что котрансплантация ММСК и ГСК уже на 1 сутки после моделирования токсического повреждения печени приводит к активации митотической активности гепатоцитов, а на 3 сутки – к снижению запрограммированной клеточной гибели (таблица 2). Повышение митотического индекса в опытной группе можно объяснить способностью ММСК к синтезу фактора роста гепатоцитов — HGF. Известно, что HGF является митогеном для гепатоцитов, а также способствует дифференцировке перисинусоидальных клеток печени в гепатоциты. Также повышению митотической активности гепатоцитов может способствовать fusion-effect –способность ГСК к слиянию с гепатоцитами.

Таблица 2

Показатели регенераторной активности гепатоцитов после введения CCl4, M±m, n=7

Примечание: * отличие от группы интактных животных, достоверно с p<0,05; ** отличие от контрольной группы животных, достоверно с p<0,05;

Выводы

Полученные результаты свидетельствуют о способности сочетанной трансплантации ММСК и ГСК снижать выраженность воспалительной реакции в печени при ее токсическом повреждении. Также котрансплантация ММСК и ГСК стимулирует митотическую активность гепатоцитов, повышает активность ферментов системы репарации ДНК. Активация репаративной системы печени, в свою очередь, обеспечивает снижение запрограммированной гибели гепатоцитов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Minot A.S, Cutler J.T. Guanidine retention and calcium reserve as antagonistic factors in carbon tetrachloride and chloroform poisoning / A.S. Minor, J.T. Cutler // J Clin Invest. – 1928. — 6(3): 369.

2. Guo, Q. Liver metabolomics study reveals protective function of Phyllanthus urinaria against CCl4-induced liver injury / Q. Guo // Chinese journal of natural medicines. — 2017. — 15 (7). — 525–0533.

3. Hu C. Chenxia Hu, Lanjuan Li. Preconditioning influences mesenchymal stem cell properties in vitro and in vivo // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2018. – Vol. 22(3). – P. 1428-1442.

4. Alfaif M. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases / Mohammed Alfaifi, Young Woo Eom, Philip N. Newsome [et al.] // Journal of Hepatology. – 2018. – Vol.68. – P. 1272-1285.

5. S. F. H. de Witte, Franquesa M., Baan C. C., Hoogduijn M. J. “Toward development of iMesenchymal stem cells for immunomodulatory therapy,” Frontiers in Immunology. – 2016. — Vol. 6. — P. 648.

6. Brown Ch. Mesenchymal Stem Cells: Cell Therapy and Regeneration Potential / Ch. Brown, Ch. McKee, Sh. Bakshi[et al.] // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. – 2019. — Vol. 13(9). – P. 1738-1755.

7. Konishi T. “Hepatic ischemia/reperfusion: mechanisms of tissue injury, repair, and regeneration,” / T. Konishi, A. B. Lentsch // Gene Expression. – 2017. — Vol. 17. — №. 4. — P. 277–287.

8. Fitter S., Gronthos S., Ooi S.S., Zannettino A.C.W. “The mesenchymal precursor cell marker antibody STRO-1 binds to cell surface heat shock cognate 70,” Stem Cells. – 2017. — Vol. 35. №. 4. — P. 940–951.

9. Human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against SCA3 by modulating the level of 70 kD heat shock protrin / T. Li, Y. Liu, L Yu [et al.] // Cellular and molecular neurobiolody. – 2018. – Vol 38. – P. 641–655.

Авторы

Маклакова Ирина Юрьевна

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической физиологии

Российская Федерация, 620028 г. Екатеринбург, ул. Репина 3

ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»

Старший научный сотрудник

Российская Федерация, 620026 г. Екатеринбург, ул. Карла Маркса 22а

makliu@mail.ru

Базарный Владимир Викторович

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии

Российская Федерация, 620028 г. Екатеринбург, ул. Репина 3

vlad-bazarny@yandex.ru

Гребнев Дмитрий Юрьевич

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патологической физиологии

Российская Федерация, 620028 г. Екатеринбург, ул. Репина 3

ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»

Старший научный сотрудник

Екатеринбург, 620026 г. Екатеринбург, ул. Карла Маркса 22 а

dr-grebnev77@mail.ru