Применение технологии прямого автоматического секвенирования для детекции мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах c неуточненным кариотипом

УДК: 616-006.446.8

DOI: 10.22138/2500-0918-2016-14-4-38-51

А.В. Виноградов, А.В. Резайкин, Д.В. Изотов, А.Г. Сергеев

Министерство здравоохранения Свердловской области, г. Екатеринбург, Российская Федерация;
Уральский государственный медицинский университет, Г. Екатеринбург, Российская Федерация;
Свердловская областная клиническая больница № 1, г. Екатеринбург, Российская Федерация

Резюме.
Цель исследования — определить частоту мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) с неуточненным кариотипом.
Материалы и методы исследования. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 41 пациента с ОМЛ в возрасте от 21 до 82 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре в период с 2008 по 2016 г. В исследуемой группе с морфологическим вариантом ОМЛ М0 по FAB-классификации наблюдался 1 пациент, М1 — 3, М2 — 23, М4 — 10, М5 — 1, острый миелофиброз — 1, неуточненный ОМЛ — 2. Пациенты с острым промиелоцитарным лейкозом, острым миеломонобластным лейкозом с патологической костномозговой эозинофилией, прочими морфологическими вариантами ОМЛ с установленным цитогенетическим статусом, а также с криптическими инсерциями в экзоне 12 гена NPM1, выявленными методом прямого автоматического секвенирования, специфическими хромосомными аномалиями t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13;q22), t(9;22)(p34;q11), abn (11)(q23), выявленными методом ПЦР, в исследование не включались. Детекцию мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 проводили методом прямого автоматического секвенирования с использованием автоматического анализатора ABI Prism 310 по прямой и обратной последовательностям. Сопоставление сегментов, выравнивание и сравнение последовательностей нуклеотидов и аминокислот проводили с использованием программного продукта MEGA, v. 5.0. Результаты исследования. Кумулятивная частота детекции функционально значимых мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при ОМЛ с неуточненным кариотипом составляла 26,8%, что было несколько ниже средней частоты криптических генных мутаций, определяемых методом секвенирования при ОМЛ с нормальным и аберрантными кариотипами. Мутации в экзонах 12–15 и 19–21 гена FLT3 определялись в 10,8% исследованных образцов (n=4), экзонах 7–12 и 16–19 гена KIT — в 15,0% (n=3), экзонах 12–13 гена ASXL1 — 12,5% (n=1), экзонах 6–9 гена WT1 — в 11,1% (n=2), экзонах 18–26 гена DNMT3A — в 11,1% (n=1), экзонах 1–4 гена NRAS — в 5,3% (n=1), экзонах 4-11 гена ТР53 — в 3,6% (n=1). Выявление вышеуказанных мутаций методом прямого автоматического секвенирования в 2, 4% случаев (n=10) позволяло уточнить прогноз ответа опухоли на проведение стандартной полихимиотерапии при ОМЛ. В 9,8% исследованных образцов (n=4) определялись одновременно по две функционально значимые мутации в исследованных генах. При этом максимальное количество патогенетически значимых молекулярных повреждений определялось в двух пробах: при ОМЛ М5 (внутренняя тандемная дупликация в гене FLT3 в сочетании с делецией в гене KIT) и ОМЛ М2 в исходе эссенциальной тромбоцитемии (делеция в гене WT1 в сочетании с несинонимичной заменой в гене DNMT3A). В двух случаях, при ОМЛ М2 с тандемной дупликацией в экзоне 9 гена TP53 и ОМЛ М2 с несинонимичной транзицией c. 1636A>G в гене KIT, определялась несинонимичная трансверсия c. 1621А>С, являющаяся, по-видимому, полиморфным аллельным вариантом гена KIT и не имеющая патогенетического и прогностического значения при ОМЛ.

Ключевые слова:
точечная мутация, острый миелоидный лейкоз, неуточненный кариотип, ген ASXL1, ген DNMT3A, ген FLT3, ген KIT, ген NRAS, ген TP53, ген WT1, прямое автоматическое секвенирование

ЛИТЕРАТУРА
1. Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. – Екатеринбург: УГМА, 1998. – 39 c.
2. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia / The Cancer Genome Atlas Research Network // NEJM. – 2013. – V.368. – N. 22. – P. 2059-2074.
3. Ho T.-C., LaMere M., Stevens B.M. et al. Evolution of acute myelogenous leukemia stem cell properties after treatment and progression // Blood. – 2016. – V.128. – N.13. – P. 1671-1678.
4. Murati A., Brecqueville M., Devillier R. et al. Myeloid malignancies: mutations, models and management // BMC Cancer. – 2012. – V.12. – P. 304.
5. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Фечина Л.Г. Диагностическое и прогностическое значение генетических аномалий опухолевых клеток при острых лейкозах // Гематология и трансфузиология. – 2000. – Т.45. – №1. – C. 28-35.
6. Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L. et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008. – 439 p.
7. Виноградов А.В. Клинико-диагностическое значение генетических аномалий при программном лечении острого миелобластного лейкоза. Дисс. на соискание ученой степени канд. мед. наук. – Екатеринбург, 2009. – 114 с.
8. Vardiman J.V., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the WHO classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes // Blood. – 2009. – V.114. – N.5. – P. 937-952.
9. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia // Blood. – 2016. – V.127. – N.20. – P. 2391-2405.
10. Metzeler K.H., Herold T., Rothenberg-Thurle M. et al. Spectrum and prognostic relevance of driver gene mutations in acute myeloid leukemia // Blood. – 2016. – V.128. – N.5. – P. 686-698.
11. Zebisch A., Lal R., Muller M. et al. Acute myeloid leukemia with TP53 germ line mutations // Blood. – 2016. – V.128. – N.18. – P. 2270-2272.
12. Levis M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013? Hematology. – 2013. – P. 220-226.
13. Li Y., Zhu B. Acute myeloid leukemia with DNMT3A mutations // Leuk. & Lymph. – 2014. – V. 55. – N. 9. – P. 2002-2012.
14. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р. и соавт. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуногистохимического метода // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2013. – №4. – С.124-127.
15. Dohner H., Estey E.H., Amadori S. et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. – 2010. – V.115. – N.3. – P. 453-474.
16. Stein E.M. Molecularly targeted therapies for acute myeloid leukemia // Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. – 2015. – P. 579-583.
17. Li S. Fighting fat in AML // Blood. – 2016. – V.128. – N.15. – P. 1910-1911.
18. Walter R.B., Othus M., Burnett A.K. et al. Significance of FAB subclassification of «acute myeloid leukemia, NOS» in the 2008 WHO classification: analysis of 5848 newly diagnosed patients // Blood. – 2013. – V.121. – N.13. – P. 2424-2431.
19. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Российский онкологический журнал. – 2013. – №4. – С. 34-35.
20. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция внутренних тандемных дупликаций и точковых мутаций гена FLT3 при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2013. – №1. – С.64-66.
21. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций экзонов 12-13 гена ASXL1 при гемобластозах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования // XXVII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 9-12 февраля 2015 г., М. – С. 148.
22. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций в гене DNMT3A при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования // Бюллетень сибирской медицины. – 2015. – Т.14. – №1. – С. 18-23.
23. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций генов KRAS и NRAS при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования // Вестник Башкирского университета. – 2014. – Т.19. — №3. – С. 845-847.
24. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Комплексное исследование мутаций генов TP53, FLT3, KIT, N-RAS, NPM1 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого секвенирования // Биомика. – 2012. – Т.3. — №1. – С. 22-243.
25. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Прогностическое значение мутаций гена ТР53 при программном лечении острых лейкозов // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2013. – Т. 24. – №2. – С. 33-40.
26. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. – 2011. – V. 28. – N. 10. – P. 2731-2739.
27. Программное лечение заболеваний системы крови // Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови / Под ред. В. Г. Савченко. – М.: Практика, 2012. — 1056 с.
28. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Афанасьев Б.В. и соавт. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению острых миелоидных лейкозов взрослых // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т.59. – S.2. – C. 2-29.
29. Виноградов А.В. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «Генанализ» № 2014610088, 09.01.2014, выдано Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
30. Виноградов А.В. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «Генсвязь» № 2016661500, 12.08.2016, выдано Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
31. Kelley L.A., Sternberg M.J.E. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server // Nat. Prot. – 2009. – V. 4. – N. 3. – P. 363-371.
32. Chan P.M. Differential signaling of Flt3 activating mutations in acute myeloid leukemia: a working model // Protein Cell. — 2011. — V. 2. — P. 108-115.
33. Smith C.C., Wang Q., Chin C.S. et al. Validation of ITD mutations in FLT3 as a therapeutic target in human acute myeloid leukaemia // Nature. – 2012. – V. 485. – N. 7397. – P. 260-263.
34. Verstraete K., Vandriessche G., Januar M. et al. Structural insights into the extracellular assembly of the hematopoietic Flt3 signaling complex // Blood. — 2011. — V. 118. — P. 60-68.
35. Dany M., Gencer S., Nganga R. et al. Targeting FLT3-ITD signaling mediates ceramide-dependent mitophagy and attenuates drug resistance in AML // Blood. – 2016. – V.128. – N.15. – P. 1944-1958.
36. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с аберрантными кариотипами // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2015. – №1. – С.77-84.
37. Szatkowski D., Hellmann A. The Overexpression of KIT Proto-Oncogene in Acute Leukemic Cells Is Not Necessarily Caused by the Gene Mutation // Acta Haematol. – 2015. – V.133. –P. 116-123.
38. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р., Изотов Д.В., Иощенко С.Е., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 И WT1 при острых миелоидных лейкозах с нормальным кариотипом бластных клеток. Вестник уральской медицинской академической науки. 2016. №2, с. 89-101, DOI: 10.22138/2500-0918-2016-14-2-89-101
39. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В. Молекулярно-генетические особенности и маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей // Успехи молекулярной онкологии. – 2015. – Т. 2. – №2. – С. 29-40.
40. Heldin C.H., Lennartsson J. Structural and functional properties of platelet-derived growth factor and stem cell factor receptors // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. – 2013. – V.5 – N.8. – P. a009100.
41. Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V. et al. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes associated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A // Blood. – 2011. – V. 118. — N. 14. – P. 3932-3941.
42. Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J. et al. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2014. – V. 111. — N. 7. – P. 2620-2625.
43. Grossmann V., Schnittger S., Kohlmann A. et al. A novel hierarchical prognostic model of AML solely based on molecular mutations // Blood. – 2012. – V.120. – P. 2963-2972.
44. Coombs C.C., Tallman M.S., Levine R.S. Molecular therapy for acute myeloid leukaemia // Nature Rev. Clin. Oncology. – 2016. – V. 13. – P. 305–318.
45. Grunwald M.R., Levis M.J. FLT3 Tyrosine Kinase Inhibition as a Paradigm for Targeted Drug Development in Acute Myeloid Leukemia // Semin. Hematol. – 2015. – V. 52. – N. 3. – P. 192 –199.

Авторы:
Виноградов Александр Владимирович
Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел специализированной медицинской помощи, в т.ч. высокотехнологичной медицинской помощи
к.м.н., главный терапевт Министерства здравоохранения Свердловской области
Российская Федерация, 620014, г. Екатеринбург, ул. Вайнера, 34 Б
a.vinogradov@egov66.ru

Резайкин Алексей Васильевич
Уральский государственный медицинский университет
кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, лаборатория молекулярной диагностики
к.м.н., доцент
Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3
alexrez@usma.ru

Изотов Денис Владимирович
Уральский государственный медицинский университет
интерн
Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3
phoenus@yandex.ru

Сергеев Александр Григорьевич
Уральский государственный медицинский университет
кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, лаборатория молекулярной диагностики
д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, научный руководитель лаборатории
620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3
sergeev@usma.ru

Дата поступления 08.11.2016

Образец цитирования:
Виноградов А.В., Резайкин А.В., Изотов Д.В., Сергеев А.Г. Применение технологии прямого автоматического секвенирования для детекции мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах c неуточненным кариотипом. Вестник уральской медицинской академической науки. 2016, №4, с. 38–51, DOI: 10.22138/2500-0918-2016-14-4-38-51

Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial» («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная.