ОЦЕНКА ВЗАИМОСВЯЗИ НАРУШЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ С ДРУГИМИ КОМПАРТМЕНТАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ПОСТКОВИДНЫХ ПАЦИЕНТОВ

М.А. Добрынина¹, А.В. Зурочка¹,², М.В. Комелькова¹,², S. Luo⁴, Д.А. Семенова³

DOI: 10.22138/2500-0918-2022-19-3-294-303

УДК 612.017. 578.834.1

¹ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, г. Екатеринбург, Российская Федерация;
² Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет)», г. Челябинск, Российская Федерация;
³ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация;
⁴ Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

Резюме. Оценка состояния клеток иммунной системы у постковидных пациентов в настоящее время остается малоисследованной. Последствия влияния самого вируса, а также препаратов, полученных пациентами при лечении инфекции, на различные системы организма, в том числе, и на иммунную, способствуют нарушениям, приводящим к постковидному синдрому. Целью исследования явилось изучение уровня цитотоксических Т-клеток и особенностей нарушений иммунной системы у пациентов, перенесших SARS-CoV-2 инфекцию. Материалы и методы исследования: обследовано 78 пациентов через 6 месяцев после перенесенного COVID-19; изучено 25 параметров системы крови (общий анализ крови), 50 параметров иммунной системы, включая Т-лимфоциты, В-лимфоциты и их функциональные маркеры, NK, TNK-клетки, фагоцитарное звено иммунной системы, и гуморальные факторы, включая общие и специфические иммуноглобулины и фрагменты комплемента. Результаты и обсуждение: при анализе полученных результатов выявлено, что у 44,8% среди обследованных лиц в 1,7 раза снижено количество цитотоксических Т-клеток. Это явление сопровождалось снижением уровня Т-лимфоцитов в целом, TNK-лимфоцитов, некоторым ростом Т-хелперов, увеличением соотношения CD4/CD8 клеток, уровней В-лимфоцитов, за счет В-общих и В1, В2-лимфоцитов не клеток памяти, относящихся к плазмоцитам (или иначе наиболее активно продуцирующим иммуноглобулины В-клеткам). Все эти данные свидетельствуют о том, что у таких пациентов в большей степени формируется иммунный ответ по ТH2-типу (усилением продукции антител), а не по ТH1-типу (формирование клеточных иммунных реакций). Кроме того, у таких больных наблюдается нарушение ТH1 ответа и увеличивается вероятность развития патологических процессов, связанных с неадекватным ответом на вирусные антигены (включая повторные заражения вирусом SARS-CoV-2, обострения хронических инфекций). Возможно, выявленные нами нарушения у таких пациентов могут способствовать возникновению или обострению аллергических и аутоиммунных процессов при нарушении функционирования (гиперактивации) В-клеточного звена иммунной системы. Все это требует дальнейшего более детального исследования как с точки зрения дальнейших клинических наблюдений за этими пациентами, так и разработки методов коррекции выявленных нарушений иммунной системы.

Ключевые слова: Тс-клетки, иммунная система, Т-лимфоциты, ТNK-лимфоциты, В-лимфоциты, общий анализ крови, SARS-CoV-2 инфекция, постковидные пациенты
Конфликт интересов отсутствует.
Контактная информация автора, ответственного за переписку:
Добрынина Мария Александровна
mzurochka@mail.ru
Дата поступления 10.05.2022 г.
Образец цитирования:
Добрынина М.А., Зурочка А.В., Комелькова М.В., Luo S., Семенова Д.А Оценка взаимосвязи нарушения цитотоксических Т-лимфоцитов с другими компартментами иммунной системы у постковидных пациентов. Вестник уральской медицинской академической науки. 2022, Том 19, №3, с. 294–303, DOI: 10.22138/2500-0918-2022-19-3-294-303

Введение
Развитие SARS-CoV-2 инфекции характеризуется повреждением различных звеньев иммунной системы, которые вовлекаются в процесс противодействия вирусу, и эти повреждения могут оставаться достаточно длительное время. Выявлено, что у пациентов SARS-CoV-2 определяются различные нарушения со стороны Т-клеток [4].
У больных COVID-19 отмечается уменьшение количества CD3+CD4+ T-лимфоцитов, CD3+CD8+T-лимфоцитов, CD19+B-лимфоциты и CD16+CD56+NK-клетки в периферической крови [9]
В то же время, при особо тяжелом течении заболевания отмечается сверхактивация Т-клеток, повышение CCR4+ CCR6+ Th17 и повышение активности и количества цитотоксичных CD8+ Т-клеток в периферической крови [10]
Необходимо отметить, что описанные нарушения регуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, CD16+ CD56+ NK-клеток, C1q, а также повышение в крови IL-6, наряду с бактериальной коинфекцией, являются важными причинами развития бактериальной пневмонии, которая приводит к утяжелению состояния и, зачастую, смерти пациента [9].
Стоит отметить и роль регуляторных T-клеток при SARS-CoV-2. Было показано, что Fox3P+CD25+CD4+T-reg накапливаются в лимфатических узлах средостения при вирусной пневмонии и ограничивают функцию эффекторных Т-клеток CD8. Таким образом, Treg могут играть достаточно важную роль в замедлении клиренса вируса, что приводит к быстрому прогрессированию заболевания и поражению центральной нервной системы [3].
При этом роль T-reg в развитии неврологических проявлений коронавирусных инфекций была показана и в более ранних исследованиях [7].
Как правило, все эти исследования проводились у пациентов в острую фазу развития SARS-CoV-2 инфекции. Исследование же клеток иммунной системы, в том числе и цитотоксических Т-лимфоцитов, у постковидных пациентов практически не исследовалось.
В то же время пациенты, страдающие от осложнений COVID-19, включая госпитализацию и изоляцию от членов своей семьи, испытывают сильный психологический и социальный стресс. Нельзя исключать и воздействие массированной терапии на функционирование клеток иммунной системы (так называемое ятрогенное влияние терапии, не всегда адекватной состоянию пациента). Экстремальные уровни стресса также повышают уровень цитокинов и способствуют медицинским осложнениям у пациентов с COVID-19, которые уже испытывают повреждение органов из-за цитокинового шторма [6]. Длительное стрессорное и ятрогенное воздействие также способствует формированию нарушений иммунной системы [5, 8]. Все это приводит к формированию большой группы пациентов с постковидным синдромом.
Малочисленные фундаментальные исследования состояния иммунной системы у постковидных пациентов, и в частности цитотоксических Т-лимфоцитов, отсутствие разработок подходов к терапии нарушений иммунных механизмов у таких больных может серьёзно осложнить сроки реабилитации таких постковидных пациентов и ухудшить прогноз их дальнейшей выживаемости при последующих вирусных (в том числе и сезонных) заболеваниях.
Учитывая, что Т-цитотоксические клетки (Tc, CD8+) являются одними из ключевых клеток иммунной системы [1], участвующих в противовирусной защите, мы сочли необходимым изучить параметры иммунной системы, связанные с нарушением цитотоксических Т-клеток у постковидных пациентов.
Цель исследования: изучить уровень цитотоксических Т-клеток и особенностей нарушений иммунной системы у пациентов, перенесших SARS-CoV-2 инфекцию.

Материалы и методы исследований
Были обследованы 78 пациентов, перенесших SARS-CoV-2 инфекцию. Критерием включения в группы исследований были: подтвержденный диагноз SARS-CoV-2 инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), наличие IgA, M, G к вирусу SARS-CoV-2 инфекции, данные компьютерной томографии о перенесенной пневмонии. Исследование проводилось не менее чем через 6 месяцев после перенесенной пневмонии, вызванной SARS-CoV-2 инфекцией.
Все пациенты были предварительно обследованы врачом-терапевтом и иммунологом-аллергологом для выявления сопутствующих заболеваний. Группы были рандомизированы по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям по критерию χ². Пациенты были разделены на 2 группы сравнения: 1. Пациенты с уровнем цитотоксических Т-клеток ниже нормы. 2. Пациенты с нормальным уровнем цитотоксических Т-клеток. За норму цитотоксических Т-клеток были приняты данные, представленные в монографии Зурочка А.В. и соавт. (2018) [1]. Все исследования были одобрены Независимым локальным этическим комитетом при ГАУЗ ОТКЗ «Городская клиническая больница №1» г. Челябинска, протокол №8 от 11.04.2022, на базе которой проводились данные исследования.

Иммунологические исследования
Общий анализ крови (25 параметров: лейкоцитарный, эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения), количественный и качественный состав ростков кроветворения проведен стандартизованным методом на гематологическом анализаторе Medonic M20 (Швеция).
Методом проточной цитометрии CD45+ (панлейкоцитарный маркер для гейтирования лимфоцитов), CD45+, CD3+ (Т-лимфоциты), CD45+, CD3+,CD4+ (хелперы индукторы), CD45+, CD3+, CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD45+, CD3+, CD16+, 56+ (TNK-клетки), CD45+, CD3-, CD16+, 56+ (натуральные киллеры), CD45+, CD3-, CD19+, CD5+ (В-лимфоциты), CD45+, CD3+, CD4+, CD25+, CD127- (Т-регуляторные клетки/супрессоры), CD45+, CD3+, CD4+, CD25+ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45+, CD3+, HLA-DR (активированные Т-лимфоциты – поздняя активация лимфоцитов) В-клеток памяти CD27, «БекманКультер», «Биолегенда» (США). Оценку иммунного статуса осуществляли методом проточной цитометрии на цитофлюориметре «Navios» (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета (1,2)
Оценка фагоцитарной активности частиц латекса диаметром 1,7 мкм нейтрофилами (активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число); спонтанная и индуцированная НСТ-активность нейтрофилов морфологическим методом (световая микроскопия с использованием микроскопов Olimpus (Япония). Исследование проводилось общепринятыми методами оценки функциональной активности фагоцитов.
Уровни общих IgA, G, M, специфические IgM, G к короновирусу COVID-19, C1-ингибитора, С3а и С5а компонентов комплемента методом иммуноферментного и иммунофлюоресцентного анализа на иммуноферментном анализаторе Multiscan FC Thermoscientific (Китай). Исследование проводилось общепринятыми стандартизованными методами иммуноферментного анализа (ВекторБест, Россия).
Обработка и анализ данных осуществлялись с помощью R 3.1.1 12 (R Foundation for Statistical Computing, Венна, Австрия) и Microsoft Excel версии 14.0. Так как распределение в количественных данных было не нормальным (p-value теста Шапиро-Уилка <0,05), то использованные статистические критерии были непараметрическими.

Результаты исследования
Как показали наши исследования, нарушения Тс-клеток нами были выявлены у 35 пациентов (44,8%) из 78 обследованных. При этом снижение уровней цитотоксических Т-клеток у этой группы пациентов было резко, более чем в 1,7 раза, ниже, чем у постковидных пациентов, не имеющих такие нарушения. Важно, что данное нарушение связано с другими компартментами иммунной системы — Т- и В-лимфоцитами. Так падение уровня Тс-клеток сопровождалось снижением уровня Т-лимфоцитов, ТNK-клеток при почти двукратном росте соотношения Т-хелперов к цитотоксическим Т-клеткам (CD4/CD8), уровнем Т-хелперов, В-лимфоцитов, в том числе за счет уровня В2-лимфоцитов, общих В-лимфоцитов не клеток памяти и В1, В2-лимфоцитов не клеток памяти (смотри Таблицу 1.).

Таблица 1
Показатели иммунной системы у постковидных пациентов с нарушением уровня цитотоксических Т-клеток
Table 1
Immune system parameters in post-COVID patients with impaired levels of cytotoxic T cells
Показатели иммунной системы /
Immune System Indicators Группа 1. Постковидные пациенты со сниженым уровнем Тс-клеток (n=35), M±m /
Group 1. Post-COVID patients with reduced levels of Tc-cells (n=35), M±m Группа 2. Постковидные пациенты с нормальным уровнем Тс-клеток (n=43), M±m /
Group 2. Post-COVID patients with normal Tc-cell levels (n=43), M±m
T-цитотоксические (CD45+CD3+CD8+) отн. (%) / T-cytotoxic (CD45+CD3+CD8+) rel. (%) 17.774±0.757 * 28.528±1.192
T-цитотоксические (CD45+CD3+CD8+) абс. (10⁹ кл/л) / T-cytotoxic (CD45+CD3+CD8+) abs. (10⁹ cell/l) 343.686±22.359 * 651.419±34.064
T-лимфоциты (CD45+CD3+CD19-) отн. (%) / T-lymphocytes (CD45+CD3+CD19-) rel. (%) 69.309±1.426 * 73.791±1.075
T-лимфоциты (CD45+CD3+CD19-) абс.(10⁹ кл/л) / T-lymphocytes (CD45+CD3+CD19-) abs. (10⁹ cells/l) 1383.2±104.607 * 1717.465±80.16
T-хелперы (CD45+CD3+CD4+) отн. (%) / T-helpers (CD45+CD3+CD4+) rel. (%) 49.903±1.556 * 44.709±1.225
T-хелперы (CD45+CD3+CD4+) абс. (10⁹ кл/л) / T-helpers (CD45+CD3+CD4+) abs. (10⁹ cell/l) 1006.143±86.116 1051.628±56.996
Соотношение CD4+/CD8+ клеток (усл. ед) / Ratio of CD4+/CD8+ cells (arb. units) 3.037±0.193 * 1.708±0.097
TNK-лимфоциты (CD45+CD3+16+56+) отн. (%) / TNK-lymphocytes (CD45+CD3+16+56+) rel. (%) 3.92±0.433* 7.33±0.696
TNK-лимфоциты (CD45+CD3+16+56+) абс. (10⁹ кл/л) / TNK-lymphocytes (CD45+CD3+16+56+) abs. (10⁹ cell/l) 76.2±9.034 * 164.651±19.068
B-лимфоциты (CD45+CD3-CD19+) отн. (%) / B-lymphocytes (CD45+CD3-CD19+) rel. (%) 13.257±0.787 * 10.047±0.577
B-лимфоциты (CD45+CD3-CD19+) абс. (10⁹ кл/л) / B-lymphocytes (CD45+CD3-CD19+) abs. (10⁹ cell/l) 264.257±23.086 232.465±16.231
В2-лимфоциты общие (CD45+CD3-CD19+CD5-) отн. (%) / B2-lymphocytes total (CD45+CD3-CD19+CD5-) rel. (%) 9.558±0.865 * 6.603±0.599
В2-лимфоциты общие (CD45+CD3-CD19+CD5-) абс. (10⁹ кл/л) / B2-lymphocytes total (CD45+CD3-CD19+CD5-) abs. (10⁹ cell/l) 188.171±19.874* 142.14±12.592
В-лимфоциты не клетки памяти общие (CD45+CD3-D19+CD27-) отн. (%) / B-lymphocytes, not memory cells, total (CD45+CD3-D19+CD27-) rel. (%) 9.157±0.795* 5.821±0.585
В-лимфоциты не клетки памяти общие (CD45+CD3-D19+CD27-) абс. (10⁹ кл/л) / B-lymphocytes are not common memory cells (CD45+CD3-D19+CD27-) abs. (10⁹ cell/l) 178.6±19.83 * 129.535±12.511
В1-лимфоциты не клетки памяти (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27-) отн. (%) / B1-lymphocytes are not memory cells (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27-) rel. (%) 1.983±0.246 * 1.37±0.141
В1-лимфоциты не клетки памяти (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27-) абс. (10⁹ кл/л) / B1-lymphocytes are not memory cells (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27-) abs. (10⁹ cell/l) 37.4±5.221 30.721±2.828
В2-лимфоциты не клетки памяти (CD 45+CD3-CD19+CD5-CD27-) отн. (%) / B2-lymphocytes are not memory cells (CD 45+CD3-CD19+CD5-CD27-) rel. (%) 7.157±0.707 * 4.266±0.49
В2-лимфоциты не клетки памяти (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27-) абс. (10⁹ кл/л) / B2-lymphocytes are not memory cells (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27-) abs. (10⁹ cell/l) 140.857±17.239 * 94.209±10.678

Примечание: * достоверность различий между группами, р<0,05
Note: *significance of differences between groups p<0.05

Обсуждение результатов исследований
При анализе полученных результатов выявлено, что у 44,8% среди обследованных лиц в 1,7 раза снижено количество цитотоксических Т-клеток. Это явление сопровождалось снижением уровня Т-лимфоцитов в целом, TNK-лимфоцитов, некоторым ростом Т-хелперов, увеличением соотношения CD4/CD8 клеток, уровней В-лимфоцитов, за счет В-общих и В1, В2-лимфоцитов не клеток памяти, относящихся к плазмоцитам (или иначе наиболее активно продуцирующим иммуноглобулины В-клеткам). Все эти данные свидетельствуют о том, что у таких пациентов в большей степени формируется иммунный ответ по ТH2-типу (усилением продукции антител), а не по ТH1-типу (формирование клеточных иммунных реакций) [9]. Кроме того, у таких больных наблюдается нарушение ТH1 ответа и увеличивается вероятность развития патологических процессов, связанных с неадекватным ответом на вирусные антигены (включая повторные заражения вирусом SARS-CoV-2, обострения хронических инфекций). Выявленное нами снижение Тс-клеток и нарушение регуляции ТH1/ТH2 ответов также может способствовать и обострению заболеваний, вызванных персистирующими вирусами (например, герпетическими). Возможно, выявленные нами нарушения у таких пациентов могут способствовать возникновению или обострению аллергических и аутоиммунных процессов при нарушении функционирования (гиперактивации) В-клеточного звена иммунной системы. Очень важным также является и выявленное почти двукратное снижение TNK-лимфоцитов. Многие авторы относят такие нарушения этих клеток к снижению противовирусной активности иммунной системы, и также может способствовать как некачественному ответу на новые вирусные антигены, или способствовать активации хронических вирусных инфекций [9]. Все это требует дальнейшего более детального исследования как с точки зрения дальнейших клинических наблюдений за этими пациентами, так и с точки зрения разработки методов коррекции выявленных нарушений иммунной системы.

Выводы
1. У 44,8% постковидных пациентов выявляется значительное, более чем в 1,7 раза, снижение уровня цитотоксических Т-клеток.
2. Снижение уровня Тс-клеток у постковидных пациентов сопровождается снижением Т-лимфоцитов и TNK-лимфоцитов.
3. Низкий уровень Тс-клеток у постковидных пациентов сопровождается более высоким уровнем Тх, соотношения CD4/CD8 клеток, В2 общих лимфоцитов, преимущественно за счет субпопуляций В-общих и В1, В2 не клеток памяти.

Работа выполнена по теме Гос. задания «Иммунофизиологические и патофизиологические механизмы регуляции и коррекции функций организма» № гос. регистрации 122020900136-4 и поддержана грантом РФФИ и NSFC, 20-515-55003

ЛИТЕРАТУРА
1. Зурочка А.В. Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в биомедицинских исследованиях. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2018.-720 с. ISBN 978-5-7691-2374-0.
2. Хайдуков С.В., Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов»// Российский иммунологический журнал, 2014, Т.-8 (17), №4.- С. 974-992. doi:10.15789/1563-0625-2012-3-255-268
3. Girija A S S. Fox3+ CD25+ CD4+ T regulatory cells (Tregs) may transform the n-CoV’s final destiny to CNS! J Med Virol. 2020 Sep 3. doi: 10.1002/jmv.26482. doi: 10.1002/jmv.26482.
4. Jouan Y, Phenotypical and functional alteration of unconventional T cells in severe COVID-19 patients. J Exp Med. 2020 Dec 7;217(12): e20200872. doi:10.1084/jem.20200872
5. Mattos Dos Santos R. Isolation, social stress, low socioeconomic status and its relationship to immune response in Covid-19 pandemic context. Brain Behav Immun Health. 2020 Aug;7:100103. doi: 10.1016/j.bbih.2020.100103
6. Heffner K.L. Neuroendocrine effects of stress on immunity in the elderly: implications for inflammatory disease. Immunol Allergy Clin North 2011Am 31, 95–108. doi:10.1016/j.iac.2010.09.005
7. Savarin C, Bergmann CC, Hinton DR, Ransohoff RM, Stohlman SA. Memory CD4+ T-cell-mediated protection from lethal coronavirus encephalomyelitis. J Virol 2008;82:1243212440. doi: 10.1128/JVI.01267-08. Epub 2008 Oct 8.
8. Vasile C. Mental health and immunity. Exp Ther Med. 2020 Dec; 20(6):211. doi: 10.3892/etm.2020.9341
9. Wu Y, Huang X, Sun J, Xie T, Lei Y, Muhammad J, Li X, Zeng X, Zhou F, Qin H, Shao L, Zhang Q. Clinical Characteristics and Immune Injury Mechanisms in 71 Patients with COVID-19. mSphere. 2020 Jul 15;5(4):e00362-20. doi: 10.1128/mSphere.00362-20
10. Xu Z, Shi L, Wang Y, Zhang J, Huang L, Zhang C, Liu S, Zhao P, Liu H, Zhu L, Tai Y, Bai C, Gao T, Song J, Xia P, Dong J, Zhao J, Wang FS. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. Lancet Respir Med. 2020 Apr;8(4):420-422. Girija A S S. Fox3+ CD25+ CD4+ T regulatory cells (Tregs) may transform the n-CoV’s final destiny to CNS! J Med Virol. 2020 Sep 3. doi: 10.1016/S2213-2600(20)30076-X.

Авторы
Добрынина Мария Александровна
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук
К.м.н., младший научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления
Российская Федерация, 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106
mzurochka@mail.ru

Зурочка Александр Владимирович
ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН
Д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления
Научно-образовательный Российско-китайский центр системной патологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет)»
Заведующий лабораторией иммунобиотехнологии
620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург ул. Первомайская, 106
av_zurochka@mail.ru

Комелькова Мария Владимировна
ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН
Старший научный сотрудник лаборатории иммунофизиологии и иммунофармакологии
Научно-образовательный Российско-китайский центр системной патологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет)»
К.б.н., заведующая лабораторией системной патологии и перспективных лекарственных средств
620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург ул. Первомайская, 106
mkomelkova@mail.ru

Luo Shanshan
Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology
Professor
Wuhan 430022 China
shsh689@hotmail.com

Семенова Дарья Александровна
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Студентка 4 курса лечебного факультета
197022, Российская Федерация, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8
dsheverd@gmail.com