Морфофункциональные показатели печени после трансплантации ММСК животным с токсическим повреждением печени

УДК 616-092.9

И.Ю. Маклакова¹^,², В.В. Базарный¹, Д.Ю. Гребнев¹^,², В.Ч. Вахрушева¹

¹ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация;

²ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», г. Екатеринбург, Российская Федерация

Резюме. Воспаление как типический патологический процесс лежит в основе множества заболеваний. Современные тенденции лечения воспалительных заболеваний предполагают все более широкое использование клеточных технологий. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), обладая иммуномодулирующими свойствами, могут применяться для снижения воспалительных процессов и восстановления функционального состояния печени при её токсическом повреждении. Целью исследования было изучить влияние ММСК на изменение морфофункционального состояния печени при ее токсическом повреждении. Материалы и методы. В исследовании проводилась трансплантация ММСК в количестве 4 млн кл./кг мышам в физиологических условиях и в условиях токсического повреждения печени. Токсическое повреждение печени моделировалось путем введения четыреххлористого углерода (ССl₄) 50 мкл. на мышь внутрибрюшинно, однократно. Оценка морфометрических показателей печени осуществлялась на 7 сутки после моделирования патологии печени. Также производился анализ активности ферментов репарации ДНК семейства Поли-АДФ-рибозаполимеразы (PARP). Результаты. Трансплантация ММСК животным с токсическим повреждением печени приводит к повышению митотической активности гепатоцитов, увеличению количества двуядерных гепатоцитов, повышению площади ядра. Также введение ММСК способствует активации ферментов репарации ДНК семейства PARP, что привело к снижению запрограммированной клеточной гибели, уменьшению количества гепатоцитов с микроядрами. Заключение. В данном исследовании было показано, что трансплантация ММСК не влияет на физиологическую регенерацию печени, но при токсическом повреждении печени обеспечивает восстановление ее морфофункционального состояния.

Ключевые слова: плацентарные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, регенерация печени, токсическое повреждение печени

Конфликт интересов отсутствует.

Контактная информация автора, ответственного за переписку:

Гребнев Дмитрий Юрьевич

dr-grebnev77@mail.ru

Дата поступления 26.11.2020 г.

Образец цитирования:

Маклакова И.Ю., Базарный В.В., Гребнев Д.Ю., Вахрушева В.Ч. Морфофункциональные показатели печени после трансплантации ММСК животным с токсическим повреждением печени. http://vestnikural.ru/article/1156 [Электронный ресурс] Вестник уральской медицинской академической науки. 2020, Том 17, №4, с. 340–346, DOI: 10.22138/2500-0918-2020-17-4-340-346

Введение

Статья посвящена проблеме восстановления структуры печени после её токсического повреждения четыреххлористым углеродом. Недостаточная эффективность современных методов терапии острой печеночной недостаточности отражается в высоком уровне смертности, частоте осложнений, а также в снижении качества жизни пациентов.

В настоящем исследовании проводилась аллогенная трансплантация плацентарных ММСК лабораторным мышам с токсическим повреждением печени. Выбор данного вида стволовых клеток был определен их биологическими особенностями. ММСК способны к синтезу противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, TGF-β), факторов роста [1]. Иммуномодулирующее действие ММСК позволяет проводить аллогенную трансплантацию этих клеток [2, 3]. Плацентарные ММСК имеют ряд преимуществ перед ММСК, полученными из других источников. Они обладают большим пролиферативным потенциалом, а также их получение возможно неоперативным путем [4].

Цель исследования: оценка морфофункционального состояния печени после трансплантации ММСК мышам с токсическим повреждением печени

Материалы и методы

ММСК были выделены из хориона плаценты 10 мышей. Культивирование осуществлялось с использованием CO₂ инкубатора (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 37°C с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Состав среды для культивирования ММСК: MesenCult MSC Basal Medium Mouse и MesenCult™ Proliferation Supplements Mouse («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 4: 1. Также в состав данной среды входило 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада) и антибиотики — пенициллин 50 ед./мл и стрептомицин 50 мкг/мл («StemCell Technologies», Канада). Подтверждение принадлежности выделенных клеток к ММСК осуществлялось с помощью набора первичных и вторичных антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit, содержащего позитивные (integrin ß1, CD54, collagen type I и fibronectin) и негативные маркеры (CD 14, CD 45). Для оценки функциональных свойств ММСК производилась дифференцировка их в остеогенном и адипоцитарном направлении [5]. Жизнеспособность трансплантируемых клеток составила 94-96%.

ММСК третьего пассажа были введены в хвостовую вену мышам в физиологических условиях, в условиях токсического повреждения печени в количестве 4 млн. кл./кг [6]. Токсическое повреждение печени моделировалось путем введения четыреххлористого углерода (ССl₄) 50 мкл. на мышь внутрибрюшинно, однократно. Трансплантация клеток осуществлялась однократно через 1 час после моделирования патологии печени.

Животные подразделялись на 2 группы (опытная и контрольная) по 7 животных в каждой. Интактные животные — это животные без токсического повреждения печени. Животным опытных групп в хвостовую вену вводилась суспензия ММСК в дозе 4 млн кл./кг, животным контрольных групп вводили 0,9% раствор NaCl — 0,2 мл.

Производилась оценка морфометрических показателей печени на 7 сутки после моделирования патологии печени. Подготовку образцов печени для гистологического исследования осуществляли на автоматическом процессоре Leica EG 1160 (Leica. Германия) с последующей заливкой в парафин. Гистологические срезы печени толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином-эозином. Для морфометрического анализа данных использовали компьютерную программу анализа изображений (Biovision, Австрия). С этой целью производили микрофотосъемку случайных полей зрения гистологических препаратов цифровой камерой CAM V 400 (Vision, Австрия) на базе микроскопа Primo Star (Carl Zeiss, Германия) при увеличении ×100, ×400, ×1000 (не менее 10 полей зрения в каждом гистологическом срезе). Производилась оценка следующих морфометрических показателей печени: ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), количество двухъядерных гепатоцитов на 1 мм², площадь гепатоцитов, площадь ядра гепатоцитов, площадь цитоплазмы гепатоцитов, митотический индекс (МИ), апоптотический индекс (АИ), число клеток с микроядрами. Ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) определяли, как отношение ядра и цитоплазмы клетки. Митотический и апоптотический индексы выражали в промилле.

С целью оценки выраженности репаративных процессов в клетках печени производился анализ количества Поли-АДФ-рибозаполимера (PARP), который является продуктом реакции Поли-АДФ-рибозилирования. Определение уровня данного показателя осуществлялось в клетках печени с использованием первичных (Anti-Poly (ADP-Ribose) Polymer antibody, abcam) и вторичных антител (Rabbit Anti-Chicken IgY H&L (FITC), abcam) на проточном цитометре Beckman Coulter по методу A. Kunzmann, D. Lui, K. Annett на 7 сутки после моделирования токсического повреждения печени. Определялась средняя интенсивность флуоресценции популяции клеток (MFI), которая служит количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) внутри клетки.

Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).

Результаты и обсуждения

При анализе показателей морфофункционального состояния печени лабораторных животных на седьмые сутки после введения ССl₄ было отмечено увеличение митотического индекса на 2232,0 % (17,06±1,64, p<0,05). Подобный эффект можно объяснить совместным действием цитокинов и факторов роста, вырабатываемых клетками печени при повреждении. В то же время было зарегистрировано увеличение площади ядра гепатоцитов на 20,78% (60,94±4,68, p<0,05), ядерно-цитоплазматического индекса на 81,86% (0,43±0,04, p<0,05) на фоне уменьшения площади гепатоцитов на 22,65% (204,71±16,27, p<0,05), площади цитоплазмы гепатоцитов на 32,88% (143,77±14,80, p<0,05). Уменьшение площади гепатоцитов и площади цитоплазмы гепатоцитов обусловлено снижением содержания гликогена в гепатоцитах на ранних сроках после воздействия четыреххлористым углеродом [7]. Также было отмечено увеличение количества двухъядерных гепатоцитов на 63,76% (388,57±30,94, p<0,05) по сравнению с данными контрольной группы. Увеличение числа двухъядерных гепатоцитов вероятно происходит путем бимитоза и ацитокинетического митоза, что более энергетически выгодно при повреждении. Было выявлено увеличение апоптотического индекса на 849,28 % (3,74±0,31, p<0,05) и числа клеток с микроядрами на 160% (5,46±0,43, p<0,05) по сравнению с интактными животными. Данный факт может быть обусловлен повышением числа патологических митозов. Активность ферментов семейства PARP в клетках печени была увеличена на 190 % (388,57±30,94, p<0,05) по сравнению с интактной группой, что свидетельствует о компенсаторной активации процессов репарации на фоне повреждения печени (таблица 1).

Таблица 1

Показатели морфофункционального состояния печени мышей на 7-е сутки после введения ССl₄, M±m, n=7

Примечание: ¹ – отличие от интактных лабораторных животных, достоверно с p<0,05.

Таблица 2

Показатели морфофункционального состояния печени мышей на 7-е сутки после трансплантации ММСК после введения ССl₄, M±m, n=7

Примечание: ¹ — отличие от интактных лабораторных животных, достоверно с p<0,05; ² – отличие от контрольной группы лабораторных животных, достоверно с p<0,05.

В то же время на фоне введения ССl₄ после трансплантации ММСК было выявлено достоверное увеличение митотического индекса на 31,99% (22,51±1,79, p<0,05). Повышение митотического индекса может быть обусловлено продукцией ММСК фактора роста гепатоцитов (HGF). При его взаимодействии со специфическим рецептором с-met (трансмембранная тирозиновая киназа) на гепатоцитах происходит стимуляция пролиферативной активности гепатоцитов. Вместе с тем площадь гепатоцитов увеличилась на 21,33% (230,27±20,72, p<0,05) и достигла значений интактных животных, а площадь ядра гепатоцитов увеличилась на 35,47% (82,56±5,09, p<0,05), что привело к повышению ядерно-цитоплазматического индекса на 15,72% (0,56±0,05, p<0,05). Количества двухъядерных гепатоцитов также было увеличено на 21,40% (471,71±31,96, p<0,05). Вместе с тем было выявлено снижение апоптотического индекса на 24,81% (2,81±0,27, p<0,05) и числа клеток с микроядрами на 30,58% (3,79±0,27, p<0,05) по сравнению с данными контрольной группы. В то же время активность ферментов семейства PARP в клетках печени на фоне токсического повреждения при введении ММСК достоверно повысилась на 43,92% (131,4±12,0, p<0,05) по сравнению с контрольной группой. Повышение активности ферментов репарации ДНК семейства PARP может быть вызвано способностью ММСК посредством межклеточных контактов вызывать экспрессию генов, кодирующих синтез белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. Белки теплового шока (70 кДа) являются шаперонами, обеспечивающими стабильность структурных и функциональных белков клетки, в том числе ферментов, участвующих в репарации ДНК. Следствием этого будет устранение нарушений в структуре ДНК. В результате этого снижается уровень патологических митозов. Достоверных данных об отличии площади цитоплазмы гепатоцитов от показателей контрольной подгруппы не установлено (таблица 2).

Полученные данные свидетельствуют, что у лабораторных животных с токсическим повреждением печени отмечается увеличение активности репаративной регенерации печени на фоне трансплантации ММСК. При этом регистрируется снижение запрограммированной клеточной гибели, числа клеток с микроядрами, повышение активности ферментов репарации ДНК семейства PARP относительно контрольной группы.

Выводы

Таким образом, проведенные исследования отражают, что введение ММСК влияет на репаративную регенерацию печени. Восстановление морфофункционального состояния печени у лабораторных животных при введении ММСК на фоне ее токсического повреждения может быть обусловлено способностью ММСК выделять биологически активные вещества и создавать микроокружение для клеток поврежденной печени.

ЛИТЕРАТУРА

1.      Progress in mesenchymal stem cell–based therapy for acute liver failure / Y–H Wang, D–B Wu, B. Chen [et al.] // Stem Cell Research & Therapy. – 2018. – Vol. 9(1). – P. 1–9.
2.      Immunomodulatory functions of mesenchymal stem cells in tissue engineering / H. Li, S. Shen, H. Fu, [et al.] // Stem Cells International. – 2019. – P. 1–18.
3.      Insights into inflammatory priming of mesenchymal stromal cells: functional biological impacts / M. Najar, M. Krayem, M. Merimi [et al.] // Inflammation Research. – 2018. – Vol. 67(6). – P. 467–477.
4.      Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international workshop on placenta derived stem cells / O. Parolini, F. Alviano, G. P. Bagnara, G. Bilic // Stem cells. – 2008. – Vol. – 26. – P. 300–311.
5.      Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing / G. Chamberlain, J. Fox, B. Ashton, J. Middleton // In Vivo. – 2007. – Vol. 25. – P. 2730–2749.
6.      Dong S. Mechanisms of ССl₄-induced liver fibrosis with combined transcriptomic and proteomic analysis / S. Dong, Q. Chen, Y. Song // The Journal of Toxicological Sciences. – 2016. – Vol. 4. – P. 561–572.
7.      Лебедева, Е. И. Качественные и количественные показатели содержания гликогена в печени крыс в динамике развития токсического цирроза / Е. И. Лебедева, О. Д. Мяделец // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. – 2015. – № 1. – С. 31–35.
8.      Hu, C. Preconditioning influences mesenchymal stem cell properties in vitro and in vivo / Chenxia Hu, Lanjuan Li // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2018. – Vol. 22(3). – P. 1428–1442.
9.      Overexpression of c-Met in bone marrow mesenchymal stem cells improves their effectiveness in homing and repair of acute liver failure / K. Wang, Y. Li, T. Zhu [et al.] // Stem Cell Research & Therapy. – 2017. – Vol. 8(162). – P. 1–10.
10.    Le Blanc K. Mesenchymal stromal cells and the innate immune response / K. Le Blanc, L. C. Davies // Immunology Letters. – 2015. – Vol. 168(2). – P. 140–146.
11.    Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в лечении острой печеночной недостаточности после обширной резекции печени в эксперименте / В.С. Рудаков, С.Э. Восканян, И.И. Еремин // Гены & Клетки Том XI, № 4, 2016.
12.    Human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against SCA3 by modulating the level of 70 kD heat shock protrin / T. Li, Y. Liu, L Yu [et al.] // Cellular and molecular neurobiolody. – 2018. – Vol 38. – P. 641–655.

Авторы

Маклакова Ирина Юрьевна

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической физиологии

Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, г. Екатеринбург, ул. Репина 3

ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий

Старший научный сотрудник

Российская Федерация, 620026, г. Екатеринбург, ул. Карла Маркса 22а

makliu@mail.ru

Базарный Владимир Викторович

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии

Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, г. Екатеринбург, ул. Репина 3

vlad-bazarny@yandex.ru

Гребнев Дмитрий Юрьевич

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патологической физиологии

Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, г. Екатеринбург, ул. Репина 3

ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий

Старший научный сотрудник

Российская Федерация, 620026, г. Екатеринбург, ул. Карла Маркса 22а

dr-grebnev77@mail.ru

Вахрушева Виктория Чаукатовна

ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

Ассистент кафедры патологической физиологии

Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, г. Екатеринбург, ул. Репина 3

ezhik_13@inbox.ru