ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS B-9909 НА КУЛЬТУРЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ

Н.А. Забокрицкий

УДК 615.372
DOI: 10.22138/2500-0918-2022-19-3-203-209

ФБГУН Институт иммунологии и физиологии УрО РАН,

г. Екатеринбург, Российская Федерация

Резюме. Цель исследования — изучение цитопротекторного действия БАВ (метаболитов, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами рода Bacillus) стерильного фугата культуры пробиотических микроорганизмов ВКПМ Bacillus subtilis В-9909 на культуру выделенных гепатоцитов при моделировании у них токсического поражения. Получение стерильного фугата культуры ВКПМ Bacillus subtilis В-9909 проводили путем стерилизующей фильтрации культуральной жидкости данного штамма. Работа проводилась с использованием перевиваемой линии клеточной культуры Л-41, позволяющей оценивать токсичность различных субстратов на культурах клеток и выдерживающей токсическое воздействие в разных концентрациях. На первом этапе исследований для решения поставленных задач были определены максимальная нетоксическая доза стерильного фугата и минимальная токсическая доза CCl4 по отношению к клеткам культуры Л-41. На следующем этапе исследований было изучено и доказано цитопротекторное действие БАВ, входящих в состав фугата штамма Bacillus subtilis В-9909, по отношению к клеткам линии Л-41. На модели токсического поражения культуры выделенных гепатоцитов было продемонстрировано цитопротекторное и регенеративное действие БАВ в составе фугата штамма Bacillus subtilis В-9909. В доклинических исследованиях по оценке токсичности и безопасности экспериментального образца нового биогепатопротектора на экспериментальных животных было установлено, что комплекс биологически активных веществ (метаболитов), вводимый внутрижелудочно и внутрибрюшинно, является нетоксичным и безопасным для лабораторных животных и не вызывает у них каких-либо патологических изменений во внутренних органах и тканях. Основой нового биогепатопротектора, обладающего полифункциональным механизмом действия, позволяющего эффективно восстанавливать угнетенные функции печени с одновременной нормализацией иммунологических показателей, является входящий в его состав активный биокомпонент — метаболиты пробиотических спорообразующих бактерий, которые при введении в организм продуцируют комплекс биологически активных метаболитов (антибиотики, протеолитические, амилолитические и др. ферменты, иммуноглобулины, а также интерлейкины, витамины, протеины, аминокислоты и другие биоактивные вещества). Экспериментально установленное цитопротекторное действие комплекса БАВ, входящих в состав фугата культуры бацилл штамма Bacillus subtilis В-9909, позволит в дальнейшем обоснованно разрабатывать новые перспективные медицинские иммунобиологические препараты, обладающие защитным действием в отношении органов и тканей человека.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что БАВ в составе фугата штамма Bacillus subtilis В-9909 не только обладают выраженным цитопротекторным действием, но и положительно влияют на регенеративные способности клеток печени, что является значимым фактором для дальнейшего использования данного штамма в качестве биокомпонента нового иммунотропного биогепатопротектора.

Ключевые слова: метаболиты, цитопротектор, пробиотические микроорганизмы, клеточная культура, гепатоциты

Конфликт интересов отсутствует.
Контактная информация автора, ответственного за переписку:
Забокрицкий Николай Александрович
pharmusma@rambler.ru
Дата поступления 10.06.2022 г.
Образец цитирования:
Забокрицкий Н.А. Изучение цитопротекторных свойств метаболитов штамма Bacillus subtilis B-9909 на культуре выделенных гепатоцитов. Вестник уральской медицинской академической науки. 2022, Том 19, №3, с. 203–209, DOI: 10.22138/2500-0918-2022-19-3-203-209

Введение
На сегодняшний день разработка новых перспективных лекарственных кандидатов, изучение специфических фармакологических механизмов их действия на различных биологических моделях, экстраполяция фармакологических показателей на человека, доклиническое изучение безопасности созданных экспериментальных образцов являются актуальными задачами современного здравоохранения.
Воздействия на организм человека неблагоприятных экологических, климатогеографических, социальных (алкоголизация населения, бытовые отравления и др.) и профессиональных факторов, а также неблагополучная эпидобстановка могут приводить к нарушению функций ряда систем, органов и тканей макроорганизма, что обусловливает, в конечном итоге, рост заболеваемости и смертности среди населения Российской Федерации. Как правило, в патогенезе различных нозологических единиц важная роль отводится повреждению клеточных элементов тканей.
В последнее десятилетие существенно возрос интерес как ученых, так и практических врачей к пробиотическим препаратам. Значительно расширилось их применение, успешно разрабатываются оригинальные композиции и лекарственные формы пробиотиков, расширяется их производство, исследуются новые, перспективные области применения данных препаратов [1, 3, 5]. 
Все более широко в лечебную практику внедряются новые пробиотики на основе аэробных спорообразующих бацилл ( биоспорин, споробактерин, бактисубтил и др.), но до последнего времени, по данным литературы, не рассматривалось цитопротекторное действие пробиотических споро-образующих бактерий [2, 4, 7]. 
В связи с этим представляет значительный интерес изучение цитопротекторного действия комплекса биологически активных веществ (БАВ), продуцируемых пробиотическими бациллами рода Bacillus [7].

Цель исследования – оценка цитопротекторного действия БАВ (метаболитов, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами рода Bacillus) стерильного фугата культуры пробиотических микроорганизмов ВКПМ Bacillus subtilis В-9909 на культуру выделенных гепатоцитов при моделировании у них токсического поражения.

Материалы и методы
В работе использовали микроорганизмы штамма ВКПМ Bacillus subtilis В-9909.
Паспортные характеристики штамма:
Штамм ВКПМ Bacillus subtilis В-9909 депонирован в БРЦ ВКПМ.
Штамм не является генетически модифицированным. Бактериальные клетки представляют собой аэробные грамположительные спорообразующие палочки размером 0,8-2,7 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. В аэробных условиях образуют овальные споры, которые располагаются в клетках центрально. При спорообразовании раздувания клеток не наблюдается. На питательных средах: МПА, сусло-агаре, среде Громыко, среде Гаузе 2, клеточная культура растет обильно,образуя через сутки большие (до 15–20 мм в диаметре) желтовато-бежевые шероховатые колонии с выростами, край колонии волнистый, колонии агар не врастают, легко снимаются петлей. В жидких средах культура клеток образует плотную пленку с ярко выраженной складчатостью, бульон в течение всего срока культивирования остается прозрачным, при встряхивании пленка плохо разбивается. В мазках из суточной культуры, выращенной на среде Гаузе 2, обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 2,3–2,3×0,9–1,2 мкм, располагающиеся одиночно или в виде коротких цепочек. Клетки подвижные, содержат центрально расположенные споры овальной формы. При спорообразовании клетки не раздуваются. Культура не растет в анаэробных условиях. Диапазон рН для роста 6,5–7,5; оптимальная температура культивирования (361)°С. Продуцирует каталазу, реакция ± Фогес Проскуэра положительная, хорошо растет в присутствии NaCl. Гидролизует крахмал, казеин, желатин разжижает медленно, не разлагает мочевину, не образует сероводород и индол. Нитраты восстанавливает, цитрат натрия не утилизирует. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, фруктозу. Галактозу и мальтозу не использует. Штамм не обладает гемолитической, лецитиназной коагулазной активностями, не нуждается для роста в аминокислотах и витаминах. Культура обладает выраженной ферментативной активностью, характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к различным видам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Штамм является продуцентом α-интерферона. В аэробных условиях в МПБ культура образует пленку. В анаэробных условиях не растет, гидролизует мочевину. Бактериальная культура B. subtilis В-9909 образует каталазу; дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра; растет в присутствии NaCl; гидролизует крахмал и казеин; разжижает желатин. При росте в МПБ образует аммиак, не образует сероводород и индол. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обесцвечивает метиленовую синь. Не обладает коагулазной, гиалуронидазной, гемолитической лецитиназной активностями.
Не является генетически модифицированным. Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.2.731-99, штамм относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, и поэтому работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
Характеристики указанного штамма в процессе культивирования и хранения не изменяются и в полной мере соответствуют показателям, описанным в паспорте на данный штамм.
Работа проводилась также с использованием перевиваемой линии клеточной культуры Л-41 КД/84 (Авторское свидетельство № 3981708/28-13/159566; ФС-42-3724-99, рег. № по РЛС-94/161/171), находящейся на хранении в музейной коллекции соматических клеток человека и животных ЕНИИВИ.
В работе использовали фугат, полученный путем стерилизующей фильтрации культуральной жидкости штамма пробиотических микроорганизмов В. subtilis В-9909.
Получение стерильного фугата культуры В. subtilis В-9909 проводили путем стерилизующей фильтрации культуральной жидкости данного штамма.
Культивирование штамма В. subtilis В-9909 осуществляли глубинным способом на качалке (220 об∙минˉ¹°С) втечение 30 ч. При этом готовили посевной материал в концентрации 1×10⁶ кл∙смˉ³. В колбы объемом 100,0 см³ вносили по 20,0–25,0 см³ питательной среды, после чего добавляли посевной материал в указанной дозе и помещали на качалку [6].
По окончании цикла глубинного культивирования содержимое всех колб сливали в одну емкость, определяли концентрацию КОЕ (БК) в 1,0 см³ культуральной жидкости и помещали в холодильник на 24 ч (4±2°С).
Перед этапом стерилизующей фильтрации проводили центрифугирование культуральной жидкости на центрифуге ОПН-3 при 3000 об∙минˉ¹ в течение 10 мин.
Для получения стерильного фугата монтировали системы для фильтрации и стерилизовали их в автоклаве в стандартном режиме. Вакуумную фильтрацию осуществляли последовательно, через целлюлозные фильтры (d =11 мкм, 0,30 мкм и 0,22 мкм). Стерильность полученного фильтрата проверяли путем высева 0,1 см³ на тиогликолевую среду и среду 199. Срок наблюдения составлял 5 суток. Полученный фугат считали стерильным, если по окончании срока наблюдения не наблюдался рост микрофлоры в указанных средах (замутнение во флаконах) [5].
Гепатоциты получали из печени мышей-сосунков, которых умерщвляли путем цервикальной дислокации шейных позвонков. Печень диспергировали в смеси равных объемов растворов трипсина Версена. Суспензию клеток вносили в пенициллиновые флаконы и культивировали в среде. Игла с двойной концентрацией аминокислот, витаминов и 20% бычьей сывороткой. Выделенные (эксплантированные) гепатоциты в количестве (5-8)×10⁶ кл. смˉ³ инкубировали в течение 96 ч в термостате при (37±1)°С. Монослой гепатоцитов на стенках пенициллиновых флаконов был представлен в виде тонкой, белесоватого цвета пленки, плотно прилегающей к стеклу. Микроскопически гепатоциты хорошо распластаны на стекле, плотно прилегают друг к другу, имеют веретенообразную форму, четкие границы и ядро по центру клетки, группы клеток образуют однонаправленные тяжи.
Токсичность исследуемых проб оценивали in vitro по изменению пролиферативной активности клеток культуры Л-41. Методика определения токсичности основана на установлении различий между интенсивностью прироста числа клеток культуры Л-41 на разные сроки наблюдения (24, 72 и 96 ч) [4, 6]. 
Критерием проявления минимального токсического действия считали снижение более чем на 20% величины, как минимум, одного из трех показателей пролиферативной активности испытуемых проб по сравнению с контролем.
Максимальную нетоксическую дозу определяли также по сравнению показателей пролиферативной активности в испытуемых пробах и в контроле. Критерием проявления максимального нетоксического действия считали снижение не более чем на 20% величин определяемых показателей пролиферации в опытных группах, по сравнению с контролем.
Непосредственно перед выполнением анализа готовили рабочую клеточную культуру Л-41. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева при микроскопии повторностях. Из трех полученных результатов подсчета клеток рассчитывали среднее арифметическое значение, которое принимали за среднюю концентрацию клеток в рабочей культуре. Количество клеток в рабочей клеточной культуре доводили до (4-5)×10⁴ кл·смˉ³.
Через 24, 72 и 96 ч из каждых трех флаконов опытных и контрольных проб сливали ростовую среду (среда Игла и среда 199, в равных пропорциях, с добавлением 20% сыворотки крови крупного рогатого скота) и добавляли во флаконы по 2,0 см³ раствора Версена. Далее пробы выдерживали в термостате при температуре (37±1)ºС 15-25 мин, после чего проводили ресуспендирование путем интенсивного встряхивания в течение 1 мин. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева для каждой из шести (трех опытных и трех контрольных) проб не менее трех раз. Вычисляли средние величины концентрации клеток в 1,0 см³ ростовой среды.
Для исследования цитопротекторного действия стерильного фугата штамма В. subtilis В-9909 по отношению к клеточной тест-системе (популяция клеток Л-41) с воспроизведенной моделью токсического поражения вводили однократную и ½ от однократной максимальные нетоксические дозы.
Токсическое поражение популяции клеток линии Л-41 осуществляли путем введения в пенициллиновые флаконы однократной и двукратной минимальных токсических CCl₄.
Цитопротекторную эффективность стерильного фугата в условиях моделирования токсического поражения выделенных гепатоцитов определяли по изменению плотности монослоя клеток. Регенеративную способность выделенных гепатоцитов определяли по изменению митотического индекса. Клетки культивировали на покровных стеклах в чашках Петри. После образования монослоя культуральную среду добавляли CCl₄ в концентрации однократной и двукратной минимальной токсической дозы. В течение опыта (через 24, 72 и 96 ч) клетки фиксировали и окрашивали гематоксилином-эозином. Для определения митотического индекса подсчитывали количество митозов в 800–1000 клетках на 1 покровное стекло. В каждом препарате просчитывали 20 полей зрения, в трех повторностях. Изменение плотности монослоя определяли по изменению среднего числа клеток в поле зрения микроскопа.
Для исследования цитопротекторного действия БАВ стерильного фугата штамма В. subtilis В-9909 в клеточную тест-систему, представленную популяцией выделенных гепатоцитов, с воспроизведенной моделью токсического поражения вводили однократную и ½ от максимальной нетоксической дозы.
Воспроизведение токсического поражения популяции гепатоцитов осуществляли путем введения в пенициллиновые флаконы однократной и двукратной минимальных токсических CCl₄.
Общая продолжительность наблюдения за пролиферативной активностью выделенных гепатоцитов после введения CCl₄ и стерильного фугата составляла 96 ч. 
Морфологические изменения клеток изучали в световом микроскопе на живых культурах и окрашенных препаратах.
Статистическую обработку осуществляли с помощью пакетов компьютерных программ Microsoft Office Excel 2010 и “ Statistica 6.0”. Использовали метод дисперсионного анализа (ANOVA). Оценку нормальности распределения полученных данных проводили по методу Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали параметрический F-критерий Фишера в зависимости от нормальности распределения данных. Проверку статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости р<0,05.
Обсуждение
На первом этапе для решения поставленных задач были определены максимальная нетоксическая доза стерильного фугата и минимальная токсическая доза CCl₄ по отношению к клеткам культуры Л-41.
На следующем этапе исследований было изучено и доказано цитопротекторное действие БАВ, входящих в состав фугата штамма В. subtilis В-9909 по отношению к клеткам линии Л-41.
На модели токсического поражения культуры выделенных гепатоцитов было показано цитопротекторное и регенеративное действия БАВ в составе фугата штамма В. subtilis В-9909.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что БАВ (метаболиты) в составе фугата штамма В. subtilis В-9909 не только обладают выраженным цитопротекторным действием, но и положительно влияют на регенеративные способности клеток печени, что является значимым фактором для дальнейшего перспективного использования данного штамма в качестве биокомпонента нового лечебно-профилактического препарата.

Заключение
Проведены исследования по оценке цитопротекторного действия БАВ, входящих в состав стерильного фугата, полученного культуральной жидкости штамма В. subtilis В-9909, являющегося активным биокомпонентом экспериментального образца нового гепатопротекторного препарата. Экспериментально обоснованы минимальная токсическая доза CCl₄ (500 мкл·смˉ³) и максимальная нетоксическая доза стерильного фугата штамма В. subtilis В-9909 (0,1 %).
Таким образом, полученные результаты по изучению защитного действия комплекса БАВ стерильного фугата культуры пробиотических бацилл рода Bacillus на линию перевиваемых клеток Л-41 и выделенных гепатоцитов свидетельствуют об их выраженном цитопротекторном и регенеративном действии, что делает штамм В. subtilis В-9909 перспективным для конструирования нового биогепатопротектора.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ардатская М.Д., Столярова Л.Г., Архипова Е.В., Филимонова О.Ю. Метабиотики как естественное развитие пробиотической концепции. Рецепт, 2019, 2, 22, 291-298.
2. Забокрицкий Н.А. Оценка иммунотропного действия пробиотика бацилакт в составе трансдермальных терапевтических систем. Российский иммунологический журнал, 2017, 11, 2(20), 126-129.
3. Забокрицкий Н.А. Принципиальные направления научных исследований по обоснованию и разработке новых иммунобиологических препаратов. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2018, S, 81, 85-86.
4. Забокрицкий Н.А., Сарапульцев П.А. Экспериментальное обоснование возможности создания нового метаболического препарата. Российский иммунологический журнал, 2018, 3, 12(21), 295-300.
5. Забокрицкий Н.А. Фармакологическая оценка иммунотропной активности нового гелевого метабиотика на факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании термических ожогов кожи. Российский иммунологический журнал, 2020, 2, 23, 125-132.
6. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С., Булаева Г.В., Вертиев Ю.В., Винокуров А.Е., Горобец О.Б., Дарбеева О.С., Жиленков Е.Л., Зверьков Д.А., Иванова С.М., Иванова Т.С., Корн М.Я., Кривопалова Н.С., Лукин И.Н., Мельникова В.А., Нехорошева А.Г., Романова Ю.М., Сидоренко С.В., Скаженик В.Ю., Скала Л.З., Трухина Г.М. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. – СПб: Лань, 2016. – 588 с.
7. Lee N.K., Paik H.D., Kim W.S. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food science and biotechnology, 2019, Vol.28, no. 5, pp. 1297-1305.

Автор
Забокрицкий Николай Александрович
ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН
Доктор медицинских наук, доцент, старший научный сотрудник лаборатории иммунофизиологии и иммунофармакологии
620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106
pharmusma@rambler.ru

Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial» («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная.