Детекция мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 И WT1 при острых миелоидных лейкозах с нормальным кариотипом бластных клеток

УДК: 616-006.446.8

А.В. Виноградов, А.В. Резайкин, Д.Р. Салахов, Д.В. Изотов, С.Е. Иощенко, А.Г. Сергеев

стр. 89-101

Скачать статью

Министерство здравоохранения Свердловской области, г. Екатеринбург, Российская Федерация;
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация;
ГБУЗ СО Свердловская областная клиническая больница № 1, г. Екатеринбург, Российская Федерация;
ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, г. Екатеринбург, Российская Федерация

DOI: 10.22138/2500-0918-2016-14-2-89-101

Резюме. Цель исследования — определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с нормальным кариотипом бластных клеток.
Материалы и методы исследования. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 45 больных ОМЛ в возрасте от 17 лет до 81 года, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре в период с 2008 по 2015 г. В исследуемой группе с морфологическим вариантом ОМЛ М0 по FAB-классификации наблюдался 1 пациент, М1 – 3, М2 – 17, М4 – 21, М5 – 1, М6 – 1, М7 – 1. Пациенты с острым промиелоцитарным лейкозом и острым миеломонобластным лейкозом с патологической костномозговой эозинофилией в исследование не включались. Детекцию мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 и WT1 проводили методом прямого автоматического секвенирования. В 10 случаях дополнительно выполнялась трепанобиопсия подвздошной кости с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием образца костного мозга, в т.ч. проводился анализ экспрессии белка Npm1.
Результаты исследования. Частота детекции функционально значимых мутаций в исследованных экзонах генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 и WT1 при ОМЛ с диплоидным кариотипом составляла 42,2%, что было сопоставимо с общей частотой точечных мутаций, определяемых методом секвенирования при ОМЛ с аберрантными кариотипами. Мутации в экзоне 12 гена NPM1 определялись в 50,0% исследованных образцов (n=15), в экзонах 12–15 и 19–21 гена FLT3 — в 22,0% (n=9), в экзонах 1–4 гена KRAS — в 22,2% (n=2), в экзонах 7–12 и 16–19 гена KIT — в 16,7% (n=5), в экзонах 1–4 гена NRAS — в 13,0% (n=3), в экзонах 18–26 гена DNMT3A — в 8,3% (n=1), в экзонах 6-9 гена WT1 — в 4,5% (n=1), в экзонах 4-11 гена ТР53 — в 3,1% (n=1). В 24,4% исследованных проб (n=11) определялись множественные мутации (две и более), при этом наиболее часто кооперировались мутации генов NPM1 и FLT3 (9 наблюдений). Выявление дополнительных мутаций приводило во всех случаях к изменению прогноза ответа опухоли на проведение стандартной полихимиотерапии и общей вероятностной выживаемости больных ОМЛ с нормальным кариотипом. Максимальное количество молекулярных изменений (4) определялось при ОМЛ М4 в исходе ХММЛ: инсерция типа А в экзоне 12 гена NPM1, несинонимичные нуклеотидные замены c.88G>C и c.311A>C в гене KRAS, трансверсия c.2141C>G в гене DNMT3A. В двух случаях (при ОМЛ М1 и М6) одновременно определялось по три мутации (инсерция типа А в экзоне 12 гена NPM1, внутренние тандемные дупликации в гене FLT3 и трансверсия c.1621А>С в гене KIT). В четырех пробах (26,7%) были выявлены инсерции экзона 12 гена NPM1, не описанные в доступных нам источниках литературы (обозначенные нами как инсерции типа Ural-1 и Ural-2, соответственно). Установлено, что инсерция типа Ural-1, определявшаяся в трех наблюдениях и обусловливающая синтез мутантного белка Npm1, в котором формирование типичного NES-мотив сочеталось с частичной утратой NoLS-мотива, проявлялась, по данным иммуногистохимического исследования, цитоплазматической локализацией белка Npm1.

Ключевые слова: точечная мутация, острый миелоидный лейкоз, нормальный кариотип, ген DNMT3A, ген FLT3, ген KIT, ген KRAS, ген NRAS, ген NPM1, ген TP53, ген WT1, прямое автоматическое секвенирование

ЛИТЕРАТУРА
1. Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. – Екатеринбург: УГМА, 1998. – 39 c.
2. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Фечина Л.Г. Диагностическое и прогностическое значение генетических аномалий опухолевых клеток при острых лейкозах // Гематология и трансфузиология. – 2000. – Т.45. – №1. – C. 28-35.
3. Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L. et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008. – 439 p.
4. Vardiman J.V., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the WHO classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes // Blood. – 2009. – V.114. – N.5. – P. 937-952.
5. Levis M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013? Hematology. – 2013. – P. 220-226.
6. Murati A., Brecqueville M., Devillier R. et al. Myeloid malignancies: mutations, models and management // BMC Cancer. – 2012. – V.12. – P. 304.
7. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia / The Cancer Genome Atlas Research Network // NEJM. – 2013. – V.368. – N. 22. – P. 2059-2074.
8. El Hajj H., Dassouki Z., Berthie C. et al. Retinoic acid and arsenic trioxide trigger degradation of mutated NPM1, resulting in apoptosis of AML cells // Blood. – 2015. – V. 125. – P. 3447 – 3454.
9. Martelli M.P., Gionfriddo I., Mezzasoma F. et al. Arsenic trioxide and all-trans retinoic acid target NPM1 mutant oncoprotein levels and induce apoptosis in NPM1-mutated AML cells // Blood. – 2015. – V. 125. – P. 3455 – 3465.
10. Li Y., Zhu B. Acute myeloid leukemia with DNMT3A mutations // Leuk. & Lymph. – 2014. – V. 55. – N. 9. – P. 2002-2012.
11. Alpermann T., Schnittger S., Eder C. et al. Molecular subtypes of NPM1 mutations have different clinical profiles, specific patterns of accompanying molecular mutations and varying outcomes in intermediate risk acute myeloid leukemia // Haematologica. – 2016. – V. 101. – P. e55-8.
12. Dohner H., Estey E.H., Amadori S. et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. – 2010. – V.115. – N.3. – P. 453-474.
13. Stein E.M. Molecularly targeted therapies for acute myeloid leukemia // Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. – 2015. – P. 579-583.
14. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р. и соавт. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуногистохимического метода // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2013. – №4. – С.124-127.
15. Walter R.B., Othus M., Burnett A.K. et al. Significance of FAB subclassification of «acute myeloid leukemia, NOS» in the 2008 WHO classification: analysis of 5848 newly diagnosed patients // Blood. – 2013. – V.121. – N.13. – P. 2424-2431.
16. Виноградов А.В. Клинико-диагностическое значение генетических аномалий при программном лечении острого миелобластного лейкоза. Дисс. на соискание ученой степени канд. мед. наук. – Екатеринбург, 2009. – 114 с.
17. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Российский онкологический журнал. – 2013. – №4. – С. 34-35.
18. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций в гене DNMT3A при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования // Бюллетень сибирской медицины. – 2015. – Т.14. – №1. – С. 18-23.
19. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций генов KRAS и NRAS при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования // Вестник Башкирского университета. – 2014. – Т.19. — №3. – С. 845-847.
20. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Комплексное исследование мутаций генов TP53, FLT3, KIT, N-RAS, NPM1 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого секвенирования // Биомика. – 2012. – Т.3. — №1. – С. 22-243.
21. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Прогностическое значение мутаций гена ТР53 при программном лечении острых лейкозов // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2013. – Т. 24. – №2. – С. 33-40.
22. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. – 2011. – V. 28. – N. 10. – P. 2731-2739.
23. Программное лечение заболеваний системы крови // Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови / Под ред. В. Г. Савченко. – М.: Практика, 2012. — 1056 с.
24. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Афанасьев Б.В. и соавт. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению острых миелоидных лейкозов взрослых // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т.59. – S.2. – C. 2-29.
25. Виноградов А.В. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «Генанализ» № 2014610088, 09.01.2014, выдано Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
26. Изотов Д.В., Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Влияние внутренних тандемных дупликаций и точечных мутаций на функциональные свойства белка Flt3 при острых миелоидных лейкозах // Белки и пептиды. Материалы VII Российского симпозиума 12-17 июля 2015 г. – Новосибирск: ЗАО ИПП «Офсет», 2015. – С. 323.
27. Annesley C.E., Brown P. The biology and targeting of FLT3 in pediatric leukemia // Frontiers in Oncology. — 2014. — V. 4. — A. 263.
28. Chan P.M. Differential signaling of Flt3 activating mutations in acute myeloid leukemia: a working model // Protein Cell. — 2011. — V. 2. — P. 108-115.
29. Smith C.C., Wang Q., Chin C.S. et al. Validation of ITD mutations in FLT3 as a therapeutic target in human acute myeloid leukaemia // Nature. – 2012. – V. 485. – N. 7397. – P. 260-263.
30. Verstraete K., Vandriessche G., Januar M. et al. Structural insights into the extracellular assembly of the hematopoietic Flt3 signaling complex // Blood. — 2011. — V. 118. — P. 60-68.
31. Falini B., Bolli N., Shan J. et al. Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryptophan(s) are crucial for aberrant nuclear export of nucleophosmin leukemic mutants in NPMc+ AML // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 4514–4523.
32. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., et al. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias // Haematologica. – 2007. – V. 92. – P. 519–532.
33. Szatkowski D., Hellmann A. The Overexpression of KIT Proto-Oncogene in Acute Leukemic Cells Is Not Necessarily Caused by the Gene Mutation // Acta Haematol. – 2015. – V.133. –P. 116-123.
34. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с аберрантными кариотипами // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2015. – №1. – С.77-84.
35. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В. Молекулярно-генетические особенности и маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей // Успехи молекулярной онкологии. – 2015. – Т. 2. – №2. – С. 29-40.
36. Heldin C.H., Lennartsson J. Structural and functional properties of platelet-derived growth factor and stem cell factor receptors // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. – 2013. – V.5 – N.8. – P. a009100.
37. Grossmann V., Schnittger S., Kohlmann A. et al. A novel hierarchical prognostic model of AML solely based on molecular mutations // Blood. – 2012. – V.120. – P. 2963-2972.
38. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция внутренних тандемных дупликаций и точковых мутаций гена FLT3 при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2013. №1. С. 64-66.
39. Coombs C.C., Tallman M.S., Levine R.S. Molecular therapy for acute myeloid leukaemia // Nature Rev. Clin. Oncology. 2016. V. 13. pp. 305–318.
40. Grunwald M.R., Levis M.J. FLT3 Tyrosine Kinase Inhibition as a Paradigm for Targeted Drug Development in Acute Myeloid Leukemia. Semin. Hematol. 2015. V. 52. No. 3. pp. 192–199.

Авторы:
Виноградов Александр Владимирович
Министерство здравоохранения Свердловской области
отдел специализированной медицинской помощи, в т.ч. высокотехнологичной медицинской помощи
к.м.н., главный терапевт Министерства здравоохранения Свердловской области
Российская Федерация, 620014, г. Екатеринбург, ул. Вайнера, д. 34б
a.vinogradov@egov66.ru

Резайкин Алексей Васильевич
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет
кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, лаборатория молекулярной диагностики
к.м.н., ассистент
Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3
alexrez@usma.ru

Салахов Денис Ринатович
ГБУЗ СО «Свердловская областная клиническая больница №1», отделение гематологии и химиотерапии
врач-гематолог
Российская Федерация, 620102, г. Екатеринбург, ул. Волгоградская, д. 185
noo_namee@mail.ru

Изотов Денис Владимирович
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет
врач-интерн
Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3
phoenus@yandex.ru

Иощенко Сергей Евгеньевич
ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологи
к.м.н., научный сотрудник
Российская Федерация, 620026, г. Екатеринбург, ул. Карла Маркса, д. 22а
ioshhenko@inbox.ru

Сергеев Александр Григорьевич
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет
кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, лаборатория молекулярной диагностики
д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, научный руководитель лаборатории
Российская Федерация, 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3
sergeev@usma.ru

Дата поступления – 20.05.2016

Образец цитирования:

Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р., Изотов Д.В., Иощенко С.Е., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 И WT1 при острых миелоидных лейкозах с нормальным кариотипом бластных клеток. Вестник уральской медицинской академической науки. 2016. №2, с. 89-101, DOI: 10.22138/2500-0918-2016-14-2-89-101